TỔNG HỢP MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CACBONHYĐRAT

A. GIỚI THIỆU VỀ CARBOHYDRATE

I. Định nghĩa:

● Carbohydrate hay glucid là những hợp chất hữu cơ gồm những monosaccharid, những dẫn xuất hay những sản phẩm ngưng tụ của chúng

● Cacbon hydrat được biết một cách đơn giản là đường, có công thức chung là Cn(H20)m

●  Là thành phần cơ bản của thể sinh vật đặc biệt là thực vật.

II. Phân loại:

 Các hợp chất carbohydrate gồm 3 loại:

•          Monosaccharide.

 Ví dụ: Glucose và fructose.

•          Oligosaccharide

 Ví dụ: Saccharose, lactose, maltose

•          Polysaccharide

 Ví dụ: tinh bột, cellulose và glycogen. 

B. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CARBOHYDRATE

I. ĐỊNH LƯỢNG GLUXIT

1. Định lượng gluxit bằng phương pháp so màu.

   a. Nguyên tắc so màu

       Nguyên tắc của phương pháp so màu trên máy là đo mật độ quang của dung dịch rồi suy ra nồng độ, dựa vào định luật hấp phụ ánh sáng của Lambert- Beer:

                         I₀

            lg =        = k.C.b = D

                         I

     Trong đó:       

    D: Mật độ quang

    I₀: Cường độ ánh sáng ban đầu

    I:  cường độ ánh sáng khi đi qua dung dịch

    k: hằng số

    b: chiều dày lớp dung dịch (cm)

    C: nồng độ dung dịch (g/l)

    

  b. Tiến hành:

·        Chuẩn bị dung dịch so màu

·        Chọn kính lọc sáng hay chiều dài bước sóng quang phổ phù hợp với dung dịch 

·        Xây dựng đường chuẩn cho mỗi loại máy và mỗi loại dung dịch

·        Đo mật độ quang D của dung dịch

·        Sau khi có đường chuẩn ta xác định nồng độ dung dịch nằm trong vùng đó.

  1.1  Xác định các Hexoza bằng phương pháp so màu

v       Phương pháp anthrone

Ø       Nguyên tắc:

   Định lượng hexoza bằng anthrone (9,10-dihydro-9-oxoantracen). Lợi dụng phản ứng tạo màu giữa các đường và anthrone trong axit sunfuric.

Ø     Tiến hành

  Cho vào các ống thí nghiệm sạch 2ml dung dịch cần phân tích ( chứa =200mg oza tổng số). Làm sạch sơ bộ dung dịch trong nước đá 15 phút, thêm 4ml dung dịch anthrone. Lắc bằng máy lắc ống, đậy ống bằng nắp tròn thủy tinh, cho vào nồi cách thủy 800C trong 8 phút, sau đó làm nguội nhanh các ống trong thùng chứa đá, để mẫu trong bóng tối 30 phút rồi đo D ở 585nm.

Ø      Kết quả

   Khả năng hấp phụ của các hexoza khác nhau, nên hệ số hấp phụ cũng khác nhau.

  Làm thí nghiệm kiểm chứng với các oza chuẩn giống như phương pháp trên. Mặc dù khả năng hấp phụ các hexoza cực đại ở 620nm nhưng so màu ở 585nm để tránh ảnh hưởng của các protein với số lượng hơn nhiều so với phương pháp trên.

Ø     Tiến hành

  Cho vào các ống thí nghiệm sạch 2ml dung dịch cần phân tích ( chứa =200mg oza tổng số). Làm sạch sơ bộ dung dịch trong nước đá 15 phút, thêm 4ml dung dịch anthrone. Lắc bằng máy lắc ống, đậy ống bằng nắp tròn thủy tinh, cho vào nồi cách thủy 800C trong 8 phút, sau đó làm nguội nhanh các ống trong thùng chứa đá, để mẫu trong bóng tối 30 phút rồi đo D ở 585nm.

Ø      Kết quả

   Khả năng hấp phụ của các hexoza khác nhau, nên hệ số hấp phụ cũng khác nhau.

  Làm thí nghiệm kiểm chứng với các oza chuẩn giống như phương pháp trên. Mặc dù khả năng hấp phụ các hexoza cực đại ở 620nm nhưng so màu ở 585nm để tránh ảnh hưởng của các protein với số lượng hơn nhiều so với phương pháp trên.

2.1 Sắc ký trên giấy

       a. Cách tiến hành:

       - Chất hấp phụ là giấy xenluloza.

      - Hệ thống dung môi dùng để tách gluxit:

      * Butanol-axit acetic-nước (4:1:5)

        - Hóa chất dùng để tách:

      * hỗn hợp difenilamin anilin- axit octophosphoric

       - Chấm dung dịch phân tích lên các điểm cách bìa tờ giấy sắc ký 1 khoảng. Sau khi cho bay hơi đặt giấy vào máng đựng dung dịch gọi là pha di động. Các cấu tử trong hỗn hợp sẽ chuyển động theo những tốc độ khác nhau và được tách riêng ra. Khi hiện hình và sấy sẽ xuất hiện thành các vết.

b. Cách xác định gluxit trên sắc ký đồ đã hiện hành theo 2 phương pháp

  - Phương pháp mật độ quang: độ đậm đặc của các vết được đo bằng quang sắc kế tự ghi. Sau đó sử dụng đường chuẩn hoặc các mẫu đối chứng của các loại gluxit tinh khiết cho biết nồng độ trước.

  - Phương pháp có tách vết: hòa tan các vết bằng dung môi, sau đó xác định khả năng hấp thụ của các dung dịch có màu. Phương pháp này phù hợp với lượng lớn nhất cho mỗi gluxit là 50g và sử dụng dung môi chuẩn biết trước lượng gluxit tương ứng.

  c. Xác định gluxit trên sắc ký đồ không hiện hình

   Đánh dấu sự dịch chuyển các gluxit trên sắc ký đồ, sau đó tách các đường ra và định lượng chúng bằng phương pháp sắc ký( cho tất cả các vết).

   II.  Định lượng tinh bột

    Tinh bột là chất dự trữ của thực vật, là nguồn thức ăn và nguồn cung cấp năng lượng chính cho người và động vật.

    Tinh bột không tan trong nước lạnh. Khi đun nóng với nước thì trương lên và tạo thành hồ (hồ tinh bột), cho màu xanh (đôi khi màu tím đỏ) với iod, không có tính khử. Tinh bột bị thuỷ phân bởi acid đậm đặc (HCl, H2SO4).

  1.  Xác định hàm lượng tinh bột bằng phương pháp Everse      

    a. Nguyên tắc: 

      Thủy phân tinh bột bằng axit HCl loãng, sau đó đo góc quay cực của dung dịch thủy phân, tính nồng độ dung dịch khi đã biết góc quay cực riêng phần của tinh bột đó

b. Cách tiến hành:

·        Lấy 2-3g tinh bột cho vào bình định mức 100ml qua phễu nhỏ, thêm vào 50ml HCl nồng độ 1,125% lắc đều.

·        Cho vào nồi cách thủy đã đun sôi, 3 phút đầu lắc nhẹ bình đều đặn và thường xuyên, sau 15 phút lấy bình ra, thêm nước cất đến thể tích 80-90ml rồi làm nguội đến 20oC.

·        Làm trong dung dịch và kết tủa protit bằng 4ml dung dịch Molipdat amonion. Cũng có thể làm trong dịch lắng protit dung dịch bằng 0,5-2ml dung dịch axit Vonframic 4%.

·        Sau khi lắng protit cho thêm nước cất đến khấc độ, lắc đều, lọc. Mẻ đầu đổ đi và phân cực trong ống 200ml

  

c. Tính kết quả:

 Dựa vào công thức:

Trong đó:

       α: góc quay cực đo được;

       l: chiều dài ống phân cực, dm;

       [α]D20 góc quay cực riêng (tra bảng) 

       0,3462 hệ số chuyển đổi từ phân cực kế sang đường kế 

2. Định lượng tinh bột bằng phương pháp thủy phân

 2.1  Thủy phân trực tiếp bằng acid.

   a. Nguyên tắc:

     Dựa trên sự thủy phân hoàn toàn tinh bột bằng acid thành  glucose. Sau đó dùng một trong các phương pháp định luợng glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 để xác định được hàm lượng tinh bột.

(C6H10O5)n + n H2O  → n C6H12O6

         162,1                              180,12

b. Tiến hành

    Cân chính xác 1-2 gam bột (chứa khoảng 200-250 mg tinh bột) đã nghiền nhỏ và sấy khô trước khi cân, cho vào bình tam giác dung tích 100ml, thêm vào đó 50 ml nước cất, lắc đều để yên 30-45 phút. 

    Lọc qua giấy lọc, rửa cặn bằng nước cất 2-3 lần. Chọc thủng giấy lọc và chuyển bột vào bình tam giác có chứa 25ml HCl 5%. Đem đun cách thủy qua ống sinh hàn trong 3-5 giờ.  Sau khi tinh bột đã thủy phân hoàn toàn, làm lạnh dung dịch.Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 0,5 % đến pH 5,6-6,0 (có thể thử bằng giấy quỳ).  Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml. Khử tạp bằng Pb(CH3COO)2  30% và loại lượng muối chì thừa bằng 20ml dung dịch Na2SO4 bão hòa. Thêm nước cất đến vạch, lắc đều và lọc.

    Định lượng đường glucose trong dung dịch bằng phương pháp Bertrand, từ đó tính được hàm lượng tinh bột.

   

c. Tính kết quả

    Hàm lượng tinh bột trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:

Trong đó:

 X:  hàm lượng tinh bột tính bằng %

 a :  số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với số ml KMnO4 dùng để chuẩn độ mẫu phân tích trừ đi số ml KMnO4  dùng để chuẩn độ mẫu không.

 V1: thể tích mẫu lấy đem xác định đường khử

 V : thể tích pha loãng mẫu (100ml)

 m: lượng mẫu đem phân tích

 0,9: hệ số đổi glucose thành tinh bột

2.2  Thủy phân trực tiếp bằng enzym sau thủy phân bằng acid

 ·  Dùng men trong dịch chiết mạch nha ( Enzyme amylase) thủy phân thành đường hòa tan ( maltoso).

 · Thủy phân các đường đôi( maltose) = acid cho ra glucose.

 · Định lượng glucose sẽ được lượng tinh bột.

 2.3  Phương pháp của Purse

  · Loại các đường tự do trong nguyên liệu bằng cồn loãng.

  · Hòa tan tinh bột bằng aicd Percholoric loãng .

  · Tạo phức tinh bột- iod

  · Phá phức và thủy phân tinh bột bằng acid- glucos

  · Định lượng glucose được lượng tinh bột.

III. Định lượng cellulose

     ·  Cellulose la polysaccharide chũ yếu ở thành tế bào thực vật. Là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các lien kết mắt xích β-D-Glucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n

     ·  Là chất màu trắng, không mùi, không vị. Cellulose không tan trong nước và các dung môi hữu cơ thông thường. Tan trong một số dung dịch acid vô cơ mạnh như: HCl, HNO3,... một số dung dịch muối:  ZnCl2, PbCl2,...

  a. Nguyên tắc:

     Định lượng cellulose dựa trên tính chất bền của cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu.

     Các chất khác thường đi kèm theo cellulose như hemicellulose, lignin, tinh bột ...ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hóa và phân giải sau đó tan vào dung dịch sau khi xử lý nguyên liệu.

  b. Tiến hành 

    Cân chính xác 1-2 gam mẫu cho vào bình tam giác 200ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp vào ống sinh hàn đun hoàn lưu trong 30 phút kể từ lúc sôi. Chú ý đừng để bọt trào lên.

    Lọc qua giấy lọc đã biết trọng lượng hoặc ly tâm. Rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH 0,5% nóng. Tiếp tục cho cặn tác dụng với 10ml HCl 10%. Thêm vào đó 10ml dung dịch natri hypochlorite từng giọt một, vừa cho vừa khuấy đều. Để yên trong 5 phút rồi lọc qua giấy lọc đã biết trọng lượng hoặc ly tâm. Cho cặn lại tiếp tục tác dụng trở lại với NaOH 0,5% ở nhiệt độ 400C. Để yên vài phút và ly tâm. Làm như thế 1-2 lần nữa để có cellulose thật trắng. Sau cùng rửa sạch thật kỹ bằng nước sôi. Sấy khô và cân.

   c. Tính kết quả

Hàm lượng cellulose được tính theo công thức sau:

Trong đó:

     a: trọng lượng cellulose (g)

    m: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g)

IV. Định lượng Pectin

·       Pectin được thu nhận từ dịch chiết của các nguyên liệu thực vật, thường là táo hay các quả có múi

·        Pectin là một loại phụ gia quý và vô hại, được sử dụng với liều lượng phụ thuộc vào từng quy trình công nghệ.

·        Các pectin là chất keo háo nước, có khả năng hydrat hóa cao nhờ sự gắn các phân tử nước vào nhóm hydroxyl của chuỗi polymethyl galacturonic

     1. Nguyên tắc:

        Acid pectic là sản phẩm thủy phân pectin bởi dung dịch kiềm nhẹ hoặc enzyme pectinase. Định lượng acid pectic sinh ra bằng cách kết tủa với Ca2+ tạo canxi pectat. Rửa sạch, sấy khô và cân lượng tủa tạo thành từ đó tính ra hàm lượng acid pectin

     2. Cách tiến hành

·           Cân khoảng 10g mẫu vào bình, cho thêm 100ml NaOH 0,1N. Để hỗn hợp qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin.

·           Lọc hỗn hợp qua giấy lọc và thêm 50ml CH3COOH 1N vào dịch lọc.

·           Sau 5 phút, thêm 50ml CaCl2 2N và giữ 1 giờ

·           Đun sôi hỗn hợp trong 5 phút rồi lọc qua giấy lọc đã được sấy đến khối lượng không đổi và cân (m1).

·           Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng đến khi không còn ion Cl- (thử nước rửa bằng dung dịch AgCl 1% đến khi không có tủa trắng).

·           Cho giấy lọc có kết tủa vào tủ sấy, sấy đến khối lượng không đổi và cân (m2).

3. Tính kết quả

Hàm lượng pectin trong mẫu được tính theo công thức:

                                                               

Trong đó:

m: khối lượng mẫu phân tích (g)

m1: khối lượng giấy lọc (g)

m2: khối lượng giấy lọc và tủa pectate canxi (g)

0,92: hệ số chuyển đổi từ canxi pectat về pectin (nghĩa là pectin chiếm 92% khối lượng canxi pectat).

C. KẾT  LUẬN

  Tóm lại cacbonhydrat là một hợp chất rất quan trọng đối với đời sống con người. Chúng có nhiều chức năng như:

    - dự trữ năng lượng.

    - cấu trúc. 

    - vận chuyển

   Bên cạnh đó cacbonhydrat là một hợp chất rất dể biến đổi trong quá trình chế biến do chịu nhiều tác động vì vậy việc phân tích và kiểm tra thành phần cacbonhyrat của nguyên liệu thực phẩm, sự thay đổi của chúng trong các quá trình công nghệ đóng một vai trò rất quan trọng.

Hầu hết các quy trình sản xuất thực phẩm đều cần kiểm tra và phân tích thành phần cacbonhydrat.